Caracterização por citometria de fluxo das células de sangue, medula óssea e aorta de camundongos hipertensos

Nome: Bianca Prandi Campagnaro
Tipo: Tese de doutorado
Data de publicação: 07/12/2012
Orientador:

Nomeordem decrescente Papel
Silvana dos Santos Meyrelles Orientador

Banca:

Nomeordem decrescente Papel
Elisardo Corral Vasquez Coorientador
LEONARDO DOS SANTOS Examinador Interno
Silvana dos Santos Meyrelles Orientador
Valdo José Dias da Silva Examinador Externo

Resumo: Campagnaro BP. Utilização da citometria de fluxo para análise do efeito da hipertensão renovascular 2R1C sobre células hematopoiéticas e endoteliais de camundongos. [tese] Vitória: Universidade Federal do Espírito Santo, 2012. 167f. A angiotensina II foi considerada durante muito tempo apenas como um hormônio vasoativo. Entretanto, sabe-se que além de um potente vasoconstritor, a angiotensina II apresenta funções biológicas importantes na regulação do crescimento e proliferação celular, além de atuar como imunomodulador indutor de
respostas inflamatórias. Apesar de muitos estudos demonstrarem que a
angiotensina II aumenta a produção de ROS, levando a ativação de mecanismos de apoptose em órgãos-alvo da hipertensão, pouco se sabe a respeito dos efeitos da hipertensão renovascular 2R1C sobre células hematopoiéticas e endoteliais. Por isso, este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da hipertensão renovascular 2R1C sobre células sanguíneas, endoteliais e de medula óssea, por citometria de fluxo, em camundongos. Para isso, camundongos C57 machos (~23g) foram separados em dois grupos Sham (n=10) e 2R1C (n=10). A hipertensão foi induzida no grupo 2R1C pela colocação de um clipe de aço ao redor da artéria renal esquerda. O grupo Sham foi submetido ao mesmo procedimento cirúrgico, porém sem a colocação do clipe. Após 14 dias, os animais tiveram sua artéria carótida cateterizadas para medidas hemodinâmicas. Em seguida, os animais foram eutanasiados, e o sangue coletado por punção cardíaca. Após a perfusão, as células
endoteliais foram mecanicamente isoladas da aorta torácica e mantidas em solução de HBSS. As células da medula óssea foram isoladas dos fêmures e tíbias e colocadas em PBS. As células foram quantificadas em câmara de Neubauer. A identificação de células endoteliais foi realizada por imunofenotipagem utilizando o anticorpo CD31-APC (5μl/106 células). Para análise do estresse oxidativo 106 células foram diluídas em PBS e incubadas com 160μM de DHE e 20mM de DCFH-DA por
30 minutos a 37ºC no escuro e, depois lavadas e ressuspendidas em 0,5ml de PBSiFBS. Para a análise de apoptose 106 células foram ressuspendidas em tampão de ligação e incubadas com 5μl de anexina V-FITC e 5μl de iodeto de propídeo (PI) a temperatura ambiente, por 15 minutos, no escuro e foram ressuspendidas em 0,5ml de tampão de ligação. Para avaliar o conteúdo de DNA, 106 células foram fixadas
em etanol 70% gelado, lavadas com PBS e ressuspendidas em 200μl de solução de coloração (20mg/ml RNAse, 500μg/ml PI, 10% Triton X-100). As amostras foram mantidas em gelo até o momento da aquisição dos dados pelo citômetro de fluxo FACSCanto II. Em cada experimento foram avaliadas 30000 células. Os dados foram analisados com o auxílio dos softwares BDFACSDiva e FCS Express 4.0. Os dados estão expressos como média±EPM e a análise estatística foi realizada por
teste t de Student ou Wilcoxon. Como esperado os animais 2R1C apresentaram níveis maiores de pressão arterial (144±5,6 mmHg) quando comparados com os respectivos controles (103±0,8 mmHg). A análise por citometria de fluxo mostrou aumento na produção de O2•- nas células sanguíneas (Sham: 941±63 vs. 2R1C: 2155±289 a.u.), endoteliais (Sham: 432±51 vs. 2R1C: 2630±184 a.u.) e da medula
óssea (Sham: 1309±175 vs. 2R1C: 12036±2205 a.u.) de animais 2R1C quando compara aos animais Sham. Simultaneamente, também observamos aumento na produção de H2O2 nas células sanguíneas (Sham: 252±23 vs. 2R1C: 531±48 a.u.), endoteliais (Sham: 300±30 vs. 2R1C: 1049±112 a.u.) e da medula óssea (Sham: 2107±222 vs. 2R1C: 7517±1067 a.u.) dos animais hipertensos comparado aos
animais normotensos. A análise de apoptose pela marcação com AnexinaV-FITC/PI, mostrou que os animais hipertensos apresentam mais apoptose em células sanguíneas (Q2Sham: 1.5±0.1 vs. Q22R1C: 15.3±3.8; Q4Sham: 1.6±0.2 vs. Q42R1C: 18.3±4.3 %), endoteliais (Q2Sham: 1.2±0.2 vs. Q22R1C: 21.1±3.0; Q4Sham: 12.5±2.6
vs. Q42R1C: 31.2±2.4 %) e de medula óssea (Q2Sham: 5.7±0.6 vs. Q22R1C: 22.5±2.5; Q4Sham: 12.9±1.1 vs. Q42R1C: 27.2±2.5 %) nos animais do grupo 2R1C quando comparado aos Sham. Além disso, as células da medula óssea dos animais 2R1C (1.54±0.26 %) apresentaram aumento na fragmentação do DNA quando comparado com os animais Sham (0.50±0.09 %). Nossos resultados sugerem que a hipertensão renovascular 2R1C aumenta a produção de espécies reativas de
oxigênio levando ao estresse oxidativo e, conseqüentemente a apoptose em células sanguíneas, endoteliais e de medula óssea isoladas de camundongos hipertensos.
Além disso, neste modelo de hipertensão experimental as espécies reativas de oxigênio aumentadas interagem com o DNA das células, fragmentando-o.
Palavras-chave: Hipertensão renovascular. Angiotensina II. Citometria de fluxo. ROS. Apoptose. Fragmentação do DNA

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