ANÁLISE DE CELL-FREE DNA CIRCULANTE EM MODELOS EXPERIMENTAIS DE LESÃO CARDÍACA AGUDA
Nome: LUIZ RICARDO RODRIGUES SILVA
Data de publicação: 08/02/2024
Banca:
Nome |
Papel |
|---|---|
| LUCIENE CRISTINA GASTALHO CAMPOS LUIZ | Examinador Externo |
| SILVANA DOS SANTOS MEYRELLES | Examinador Interno |
Resumo: O DNA, fundamental na codificação genética e regulação do metabolismo em organismos
vivos, tradicionalmente confinado ao interior do núcleo de células eucariontes e nas
mitocôndrias, tem sua presença reconhecida também no ambiente extracelular,
denominado DNA livre de células (cell-free DNA, ou cf-DNA). O cf-DNA foi identificado
no plasma de pessoas saudáveis pela primeira vez em 1948. Entretanto, essa fita dupla
altamente fragmentada pode ser detectada em diferentes fluidos corporais (plasma/soro,
urina, líquido cefalorraquidiano, etc.) tanto em condições fisiológicas como após exercício
e no envelhecimento, mas também patológicas em decorrência de morte celular, ou pela
liberação ativa de cf-DNA por células vivas. Assim, o presente estudo se propôs a avaliar
possíveis elevações do nível de cf-DNA em modelos experimentais de dano cardíaco.
Foram utilizados ratos Wistar machos adultos, distribuídos em 8 grupos: Ct (controle,
recebeu 10 mL/kg de solução salina i.p.), Fe250 (250 mg/kg de ferro-dextrano i.p. em
mesmo volume final), Fe500 (500mg/kg) e Fe1000 (1000mg/kg), Dox20 (doxorubicina
20mg/kg i.p) e Dox30 (30mg/kg), e Iso150 (isoproterenol 150mg/kg s.c. dividida em duas
doses) e Iso300 (300mg/kg s.c. dividida em duas doses). Quarenta e oito horas após,
amostras de sangue e tecidos foram coletadas, e o soro foi obtido pela centrifugação do
sangue, no qual foram medidos capacidade de ligação de ferro, creatinina,
creatinofosfoquinase, desidrogenase láctica, ferro sérico, fosfatase alcalina, saturação da
transferrina, transaminase oxalacética, transaminase pirúvica, troponina e transferrina.
Além disso, os níveis de ferro tecidual foram avaliados por espectrometria de emissão
óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) no coração, fígado e rins. Os níveis
de cf-DNA foram estimados por fluorimetria usando corante para ácidos nucleicos
SYBR®, ou por meio de PCR quantitativo (qPCR) utilizando primers específicos para
fragmentos de genes mitocondriais NADH-ubiquinona oxidorredutase da cadeia 6 (ND6)
e citocromo B (Cyt-B). Finalmente, foram avaliados dois produtos de estresse oxidativo no
soro dos diferentes grupos experimentais, pela quantificação de malondialdeído (MDA)
como estimativa da peroxidação lipídica, e os produtos protéicos de oxidação avançada
(AOPP) como estimativa da lesão oxidativa em proteínas. Os ratos de todos os grupos Fe
apresentaram um aumento dos níveis séricos de ferro, ferritina, e saturação da transferrina,
e elevação dos marcadores de dano cardíaco, Troponina I e DHL nos grupos Fe 500 e Fe
1000, e especialmente DHL, que se correlacionou positivamente com os níveis de ferro
sérico e cardíaco. A creatinina sérica foi elevada nos grupos Fe 250 e Fe 1000, e o seu nível
se correlacionou com o ferro sérico e também com o conteúdo de ferro depositado no tecido
renal. Ademais, somente a TGO foi significantemente aumentada pela intoxicação de ferro
nas maiores doses, cujos níveis séricos se correlacionaram positivamente com o ferro sérico
e o conteúdo de ferro hepático. Finalmente, houve elevação do TBARS e AOPP em todos
os grupos Fe, sendo esse aumento proporcional ao nível de intoxicação e tendo seus valores
apresentado correlações positivas com o nível de ferro sérico, assim como os níveis de
DHL, creatinina e TGO. Apesar desses resultados, não foi possível avaliar o cf-DNA nos
grupos intoxicados por ferro pelos métodos fluorimetria e qPCR. Entretanto, a
quantificação de cf-DNA por qPCR foi bem-sucedida no grupo controle e nos demais
modelos utilizados. No modelo de isoproterenol, não houve qualquer alteração no perfil do
ferro sérico ou no conteúdo de ferro tecidual, mas houve elevação de DHL e Troponina I,
em mudanças nos demais parâmetros bioquímicos. No modelo de toxicidade por
doxorrubicina, apesar de igualmente não haver influências sobre o perfil do ferro sérico e
tecidual, houve elevação da DHL, creatinina e TGP na maior dose, e de TGO em ambas as
doses estudadas. Na análise do cf-DNA desses dois modelos apresentaram uma maior
amplificação (1/CT) dos fragmentos Cyt-B e ND6, em uma relação dose-efeito. Esse
resultado foi reforçado pela análise da concentração de cf-DNA Cyt-B e ND6 que
aumentaram tanto para o grupo Iso 150 (45,91 ng ± 0,94 ng/ml e 47,30 ± 0,58 ng/ml,
respectivamente) quanto para o grupo Iso 300 (46,97 ± 0,54 ng/ml e 48,47 ± 0,87 ng/ml,
respectivamente) em relação ao grupo Ct (41,21 ± 0,42 ng/ml e 43,91 ± 0,62 ng/ml).
Igualmente, no modelo de injeção de doxorrubicina, tanto o grupo Dox20 quando o grupo
da dose mais alta Dox30 aumentaram o cf-DNA de Cyt-B e ND6 no soro (47,86±0,84
ng/ml e 50,89±1,03 ng/ml, respectivamente). Além disso, foi possível identificar
correlações positivas entre os níveis desses fragmentos na circulação e alguns dos
marcadores séricos utilizados: O Cyt-B se correlacionou positivamente com DHL e
troponina I no modelo de injeção de isoproterenol, enquanto os níveis de Cyt-B e ND-6 se
correlacionaram positivamente com DHL, TGP, TGO e creatinina no modelo de toxicidade
com doxorrubicina. Em conclusão, a intoxicação aguda com ferro parenteral cursa com
aumento dos níveis de ferro sérico e deposição de ferro nos tecidos, e modifica marcadores
séricos de lesão que se correlacionam com o nível de intoxicação, e com o nível de estresse
oxidativo. Adicionalmente, enquanto os dois outros modelos de cardiopatia se mostraram
distintos na amplitude dos efeitos em diferentes órgãos, ambos cursaram com elevação dos
níveis de DNA mitocondrial para os dois genes estudados (Cyt-B e ND-6), o que indica
que a análise desses fragmentos circulantes pode ser um biomarcador útil, pois se
correlacionam positivamente com diferentes biomarcadores de dano tecidual nessas
situações.
