Avaliação da via de sinalização da proteína cinase D1 (PKD1), dependente da modulação endotelial, sobre a reatividade vascular na hipertensão arterial (SHR)

Resumo: Os hormônios e neurotransmissores do sistema renina angiotensina e do sistema nervoso autônomo podem atuar nos vasos e coração, modulando vias de sinalização intracelular como a proteína cinase D (PKD). A PKD é uma enzima da família de serina/treonina-quinases compreendendo três isoformas de PKD homólogas (PKD1/PKCμ, PKD2 e PKD3/PKCν) e pertence à superfamília da Ca2+-calmodulina dependente de proteína cinase (CaMK). A isoforma PKD1 é cada vez mais reconhecida como um regulador chave de múltiplos processos fisiológicos, incluindo: transdução de sinal, proliferação e diferenciação celular, transporte através da membrana, secreção, expressão gênica, utilização de substrato. Estudos têm demonstrado que a PKD1, ativada pelas espécies reativas de oxigênio (EROs), está envolvida na sinalização da sobrevivência celular frente ao estresse oxidativo. Em condições fisiológicas, as EROs atuam como sinalizadoras de respostas biológicas. No entanto, em quantidades excessivas, as EROs podem causar danos a macromoléculas (DNA, lipídeos e proteínas), resultando em morte celular e apoptose. Investigações da função da PKD1 na via NADPH oxidase (NOX) são cada vais mais relevantes na busca de conhecimento de novas terapias para as doenças cardiovasculares, como por exemplo a hipertensão arterial (HA). As NOX são as principais fontes de EROs em células vasculares. As EROs originadas dessa via enzimática participam de remodelação vascular, crescimento e migração celular, apoptose, senescência, disfunção e permeabilidade endoteliais A utilização de um modelo experimental para os estudos da fisiopatologia da HA, tem sido possível, graças ao desenvolvimento de um modelo de ratos espontaneamente hipertensos (SHR), os quais apresentam um aumento gradual, tempo-dependente, da pressão arterial (PA). A disfunção endotelial, mediada por desequilíbrio na biodisponibilidade de óxido nítrico (NO) e do estresse oxidativo, é uma característica importante da HA, inclusive no modelo SHR. As enzimas responsáveis por catalisar a produção vascular de NO, a partir da L-arginina, são as óxido nítrico sintases (NOSs). As três isoformas da NOS são classificadas nos grupos: NOS constitutiva (c-NOS) e a NOS induzível (iNOS). A isoforma constitutiva carece da interação com a calmodulina, que é dependente do aumento dos níveis de cálcio, para sua ativação. Há dois tipos de c-NOS: a NOS endotelial (eNOS) e a NOS neuronal (n-NOS) que são ativadas em condições fisiológicas. Em contrapartida, a iNOS é induzida por estímulos pró-inflamatórios, e sua ativação é independente da concentração intracelular do Ca2. Por meio desse projeto, busca-se, portanto, verificar a participação da via de sinalização intracelular por meio da PKD1, na via de formação de NO e EROs, na aorta de ratos.
Neste projeto, usaremos ratos Wistar (normotensos, N=20) e ratos espontaneamente hipertensos (SHR, N=20). A reatividade vascular será estudada usando anéis isolados de aorta torácica para avaliação da contração ao estimulo α-adrenérgico (curva concentração resposta a Fenilefrina (10−10 a 3,5 x10−3 M) e da ativação de receptores AT1, usando Angiotensina II (10−10 a 10−5 M), na presença e ausência: endotélio vascular; CID 3,2 μM – um inibidor seletivo e especifico da PKD1; L-NAME 100 μM, um inibidor não-seletivo da enzima óxido nítrico sintase (NOS), Apocinina 30 μM, um inibidor da NOX. Em um outro grupo de animais, serão analisados “in vitro” a produção de EROs pela via da NOX por meio da incubação com apocinina 30 μM: 5) Wistar CID-APO (n=5), 6) Wistar Controle-APO (n=5), 7) SHR CID-APO (n=5) e 8) SHR Controle-APO (n=5). Todos os anéis de aorta dos grupos experimentais serão pré-contraidos com Fenilefrina e Angiotensina II, em ensaios separados. Por meio desse protocolo, busca-se, verificar a participação da via de sinalização intracelular por meio da PKD1, na via de formação de EROs dependente da ativação da NOX, na aorta de ratos. Nesse âmbito, a fluorescência oxidativa ao dihidroetídio (DHE) será realizada em amostras de aorta a fim de analisar a intensidade da produção de ânion superóxido em ratos Wistar e SHR. Analisaremos a produção de NO in situ em anéis de aorta de ratos Wistar e SHR com a presença e a ausência de PKD1, com o intuito de verificar se a PKD1 influencia na modulação contrátil vascular por meio da via NOS. Tal estudo será possível devido a utilização da técnica DAF-2 para a detecção do NO in situ. A participação da biodisponibilidade de NO será avaliada por meio da incubação com L-NAME 100 μM: 5) Wistar CID- L-NAME (n=5), 6) Wistar Controle- L-NAME (n=5), 7) SHR CID- L-NAME (n=5) e 8) SHR Controle- L-NAME (n=5). Todos os anéis de aorta dos 8 grupos experimentais serão pré-contraídos com Fenilefrina e Angiotensina II, em ensaios separados.
A Pressão Arterial Sistólica dos ratos será aferida indiretamente pelo método de pletismografia de cauda.
Os resultados serão expressos como média &#61617; erro padrão da média (EPM). As respostas contráteis à fenilefrina e ao KCl serão expressas em gramas de contração (g). As análises estatísticas desses dados serão realizadas por teste t, pareado e/ou não pareado, com análise de variância (ANOVA), duas vias ou três, para medidas repetidas ou completamente randomizada, seguida pelo teste post-hoc de Tukey. Valores de p<0,05 serão considerados estatisticamente significativos. Para calcular o tamanho da amostra foi seguida a fórmula estatística para o cálculo da amostra em uma população infinita.

Data de início: 2020-01-01
Prazo (meses): 36

Participantes:

Papelordem decrescente Nome
Aluno Doutorado Bruno Barcellos Jacobsen
Aluno Mestrado Michelle Rossana Martins Hortelan
Coordenador Ivanita Stefanon
Acesso à informação
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