EFEITOS DA EXPOSIÇÃO POR QUINZE DIAS AO TRIBUTILESTANHO (500 NG/KG) SOBRE A REATIVIDADE E MORFOLOGIA DA AORTA DE RATAS
Nome: CAROLINA FALCÃO XIMENES
Tipo: Dissertação de mestrado acadêmico
Data de publicação: 25/02/2016
Orientador:
| Nome | Papel |
|---|---|
| IVANITA STEFANON | Orientador |
Banca:
| Nome | Papel |
|---|---|
| JONES BERNARDES GRACELI | Coorientador |
| ADRIANE BELLÓ KLEIN | Examinador Externo |
| EDUARDO HERTEL RIBEIRO | Examinador Externo |
| IVANITA STEFANON | Orientador |
Resumo: redução da concentração de estrogênio (E2) no soro, podendo causar desregulação endócrina e efeitos tóxicos em mamíferos. A concentração de 500 ng/kg foi utilizada por ser encontrada no meio ambiente, mimetizando assim, uma exposição humana a uma concentração realística. No entanto, sua ação sobre o sistema vascular, não está bem elucidada. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da exposição de 500 ng/kg ao TBT durante quinze dias sobre reatividade vascular, e a possível relação entre anormalidades vasculares e o estresse oxidativo. Foram utilizadas ratas fêmeas Wistar (250-300 g), divididas em grupo controle e exposto ao TBT (500 ng/kg) diariamente via gavagem. A concentração de E2 no soro foi analisada por radioimunoensaio e a peroxidação lipídica foi medida na aorta usando a concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). A reatividade vascular de anéis de aorta incubados com KCl (75 mM), e logo após, com fenilefrina (10-10 3 x 10-4 M) foi avaliada na presença (E+) e na ausência do endotélio (E-). Para analisar os possíveis fatores endoteliais envolvidos no efeito do TBT, foram realizadas curvas de concentração-resposta à fenilefrina com NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) (100 μM), apocinina (30 μM), Superóxido Dismutase (SOD) 150 (U/ml), Catalase (1000 U/ml), Tiron (1 mM) e Alopurinol (100 μM). A resposta ao relaxamento induzida pelo endotélio foi avaliada através da curva de relaxamento induzida pela acetilcolina (ACh, 10-10 _ 3 x 10-4 M), e a resposta ao relaxamento mediada pelo músculo liso vascular foi testada pela curva de nitroprussiato de sódio (NPS, 10-11 3 x 10-7 M), em artérias pré-contraídas com fenilefrina (10-6 M). Para analisar a produção de ânion superóxido (O2-) in situ foi utilizado o dihidroetídio (DHE). A integridade estrutural da aorta foi avaliada através da coloração Hematoxilina e Eosina, Pricosirius Red e pela microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os dados foram expressos como média ± EPM. Para análise estatística foram utilizados teste t de Student não pareado e ANOVA 1 via para avaliação da produção de O2- in situ, sendo p < 0,05 considerado estatisticamente significante. A concentração de E2 no soro (Controle: 32,2 ± 6,6; TBT: 19,95 ± 2,3 pg/ml, n=4, p < 0,05) reduziu 38% e a peroxidação lipídica (Controle: 7,53 ± 1,26; TBT: 12,33 ± 0,81 nmol/mg proteína, n=3-5, p < 0,01) foi maior no grupo TBT. A resposta ao KCl
(Controle: 2,34 ± 0,06; TBT: 3,48 ± 0,17 g, n=10, p < 0,01) e a resposta à felinefrina (Rmáx, Controle: 1,54 ± 0,09; TBT: 4,01 ± 0,36 g, n=10, p < 0,01; pD2, Controle: -6,32 ± 0,09; TBT: -6,85 ± 0,14 g, n=10, p < 0,01) foi maior no grupo TBT. A remoção do endotélio promoveu um aumento da Rmáx no grupo controle e um aumento da pD2 no grupo TBT, porém a magnitude da resposta (analisada pela dAUC) não foi diferente entre os grupos. A administração de L-NAME promoveu aumento de Rmáx e pD2 à felinefrina, tanto na ausência quanto na presença de TBT. A magnitude desse efeito foi maior na presença de TBT (dAUC% - Controle: 55,69 ± 12,96 vs TBT 102,70 ± 16,78%). A vasodilatação induzida pela ACh (Rmáx, Controle: -105,3 ± 0,15; TBT: 91,26 ± 0,92%, n=10; pD2, Controle: -6,07 ± 0,01, n=10; TBT: -5,79 ± 0,02%, n=10, p < 0,01) e NPS (Rmáx, Controle: -99,37 ± 1,65, n=9; TBT: -80,68 ± 2,78%, n=10; pD2, Controle: -7,64 ± 0,08, n=9; TBT: 3,63 ± 0,57%, n=10; p < 0,01) foram modificadas pela exposição ao TBT. Além disso, a exposição ao TBT induziu um aumento da produção de O2- in situ principalmente no músculo, redução da espessura (Controle: 133,24 ± 5,29, n=5; TBT: 87,29 ± 0,75 μm, n=5), aumento a deposição de colágeno (Controle: 84,27 ± 2,32; TBT: 103,87 ± 1,93%, n=5, p ≤ 0,001) e desnudação endotelial com acúmulo de células vermelhas, fibrina e plaquetas em anéis de aorta. Assim, os resultados obtidos neste estudo sugerem que o TBT provoca um prejuízo na reatividade vascular de ratas fêmeas, provavelmente devido ao aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e anormalidades morfológicas.
Palavras chaves: Cloreto de tributilestanho, reatividade vascular de aorta, estresse oxidativo, estrogênio.
ABSTRACT
The tributyltin chloride (TBT) is a chemical that causes a reduction of serum estrogen (E2) levels and may cause endocrine disruption and toxic effects in mammals. The dose of 500 ng/kg was used to be found in the environment, thus mimicking a human exposure to a realistic concentration. However is not well understood. The objective of this study was to investigate the effects of exposure of 500 ng/kg of TBT for fifteen days on vascular reactivity, and the possible relationship between vascular abnormalities as a result of the development of oxidative stress. Female Wistar rats were used (250-300 g), divided into control group and exposed to TBT (500 ng/kg) daily by gavage. The E2 level in the serum was analyzed by radioimmunoassay and lipid peroxidation was measured in the aorta using the level of substances reactive to thiobarbituric acid (TBARS). Aortic rings vascular reactivity incubated with KCl (75 mM), immediately after, with phenylephrine (10-10 3 x 10-4 M) was assessed in the presence (E+) and absence of the endothelium (E-). To analyze the possible factors involved in endothelial effect of TBT were carried concentration-response curves to phenylephrine with L-NG-Nitroarginine methyl ester (L-NAME) (100 μM), apocynin (30 μM), superoxide dismutase (SOD) 150 (U/ml), Catalase (1000 U/ml), Tiron (1 mM) and allopurinol (100 μM). The relaxation response endothelium-induced was evaluated by acetylcholine-induced relaxation curve (ACh 10-10 3 x 10-4 M), and the relaxation response mediated by the vascular smooth muscle was tested by curve sodium nitroprusside (SNP, 10-11 3 x 10- 7 M) in arteries pre-contracted with phenylephrine (10-6 M). To analyze the production of superoxide anion "in situ" was used dihydroethidium (DHE). The structural integrity of the aorta was evaluated by staining hematoxyline and eosin, Pricosirius Red and by scanning electron microscopy (SEM). Data were expressed as mean ± SEM. Statistical analysis used Student's t test unpaired and ANOVA 1 way for evaluate the production of O2- in situ, with p < 0.05 considered statistically significant. The oestrogen level in serum (Control: 32.2 ± 6.6; TBT: 19.95 ± 2.3 pg/ml, n=4, p < 0.05) was decreased 38 % and the lipid peroxidation (Control: 7.53 ± 1.26; TBT: 12.33 ± 0.81 nmol/mg protein n=3-5, p < 0.01) was higher in the TBT group. The response to KCl (Controle: 2.34 ± 0.06; TBT: 3.48 ± 0.17 g, n=10, p < 0.01) and the response to phenylephrine (Emax, Control: 1.54 ± 0.09; TBT: 4.01 ± 0.36 g, n=10, p < 0.01; pD2, Control: -6.32 ± 0.09; TBT: -6.85 ± 0.14 g, n=10, p < 0.01) were higher in the TBT
group. Removal of the endothelium was associated with an increase of Emax in the control group and an increase pD2 in the TBT group, although the magnitude of the response (analyzed by dAUC) was not different between the groups. L-NAME administration promoted an increase of Emax and pD2 to phenylephrine, both in the absence and in the presence of TBT. The magnitude of this effect was greater in the presence of TBT (dAUC % - control: 55.69 ± 12.96 vs TBT 102.70 ± 16.78 %). The vasodilation induced by ACh (Emax, Control: -105.3 ± 0.15; TBT: 91.26 ± 0.92 %, n=10; pD2, Control: -6.07 ± 0.01, n=10; TBT: -5.79 ± 0.02 %, n=10, p < 0.01) and SNP (Emax, Control: -99.37 ± 1.65, n=9; TBT: -80.68 ± 2.78 %, n=10; pD2, Control: -7.64 ± 0.08, n=9; TBT: 3.63 ± 0.57, n=10; p < 0.01) were modified by exposure to TBT. Furthermore, exposure to TBT induced an increase in superoxide anion production "in situ" mainly in the smooth, reduction of wall thickness (Control: 133.24 ± 5.29, n=5; TBT: 87.29 ± 0.75 μm, n=5) increased collagen deposition and endothelial denudation with accumulation of red blood cells, fibrin and platelets in aortic rings. Thus, the results obtained in this study suggest that TBT causes an impaired vascular reactivity of female rats, probably due increased production of reactive oxygen species (ROS) and morphologic abnormalities.
Key words: tributyltin chloride, vascular reactivity aorta, oxidative stress, estrogen.
